中国化学会第32届学术年会
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一步快速检测Sirtuin活性的方法研究
王攀 安建雄 王洁 曹灼贤 李燕 何彬*

分会

第三十二分会:化学生物学

摘要

Sirtuin是一类人源的NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,共有7个亚型,分别为Sirtuin 1-7。近年来,除了去乙酰化的酶活性,Sirtuin还被报道具有去琥珀酰化[1]、去肉豆蔻酰化[2]、去4-氧代壬酰基[3]等新的酶活性。Sirtuin通过调节组蛋白或非组蛋白的各种酰化修饰,不仅广泛参与细胞的转录调控、代谢等重要生理功能,而且与衰老及衰老相关的神经退行性疾病、心脑血管疾病、癌症等疾病密切相关[4,5],因此也成为了科研人员眼中炙手可热的药物靶点。但由于缺乏高抑制活性、选择性及成药性抑制剂的发现,至今仍未有靶向Sirtuin的药物被批准上市,所以建立准确、简单、快速的Sirtuin调节剂筛选方法是必要的。 目前,Sirtuin活性检测方法主要有质谱法、高效液相色谱法、荧光法等,其中适合高通量筛选的仅有基于香豆素的荧光法和基于FRET的荧光法[6,7],但它们的检测过程均需要两步才能完成:首先经Sirtuin催化反应,然后再经胰酶水解,才能测定荧光强度。这增加了检测体系的复杂度,且在检测中易出现假阳性结果,降低了筛选的准确性。 为克服传统Sirtuin活性检测方法的缺陷,本文设计了一种一步快速检测Sirtuin活性的方法,即采用香豆素碳酸丁酯组装的酰化赖氨酸作为小分子荧光探针,当Sirtuin去除赖氨酸残基ε-NH2上的酰化修饰后,游离的氨基定量的与荧光基团上丁基氧羰酰基发生分子内的亲核取代反应,点亮荧光基团(羟基香豆素)的荧光。通过荧光强度-酶浓度、荧光强度-底物浓度、荧光强度-时间曲线、催化效率等实验研究,建立了一步快速检测Sirtuin活性的方法。通过已报道的Sirtuin抑制剂的进一步研究,验证了该体系荧光强度2 h内稳定,S/N>10、CV<10%、Z’>0.6等各项参数符合高通量筛选要求,建立了Sirtuin调节剂的高通量筛选方法。综上,我们设计开发了一类新的小分子探针,可用于一步高通量筛选Sirtuin调节剂,简化了筛选方法,提高了筛选速度与准确性。

关键词

Sirtuin;荧光探针;酶活性检测;抑制剂;高通量筛选

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